Extrusão mecanossensível de Enterovirus A71

Nature Microbiology volume 8, páginas 629–639 (2023) Cite este artigo

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O enterovírus A71 causa doença grave após infecção sistêmica, às vezes levando a disfunção neurológica com risco de vida. No entanto, na maioria dos casos a infecção é assintomática e limitada ao trato gastrointestinal, onde o vírus é amplificado para transmissão. Já foi demonstrado que os picornavírus saem das células infectadas por meio de lise celular ou secreção de vesículas. Aqui relatamos que células inteiras infectadas com Enterovirus A71 são especificamente extrudidas da superfície apical de organoides de cólon humano diferenciados, conforme observado por microscopia confocal. A sensibilidade diferencial a inibidores químicos e peptídicos demonstrou que a extrusão de células infectadas por vírus depende da detecção de força por meio de canais iônicos mecanossensíveis, em vez da morte celular apoptótica. Quando isoladas e usadas como inóculo, as células extrusadas contendo vírus intactas podem iniciar novas infecções. Em contraste, quando a detecção de força mecânica é inibida, grandes quantidades de vírus livres são liberadas. Assim, a extrusão de células vivas infectadas por vírus de tecido epitelial intacto provavelmente beneficiará tanto a integridade dos tecidos do hospedeiro quanto a disseminação protegida desse patógeno fecal-oral dentro e entre os hospedeiros.

A questão de como os vírus descendentes deixam uma célula ou tecido infectado é vital para nossa compreensão da propagação viral em um hospedeiro infectado e entre hospedeiros. Durante décadas, pensou-se que os picornavírus, como vírus não envelopados ou 'nus', transmitiam estritamente liticamente, através da ruptura dramática da célula infectada. A liberação lítica de picornavírus a partir de linhagens celulares de cultura de tecidos padrão resulta em ampla dispersão de vírions para iniciar rodadas subsequentes de infecção. No entanto, a disseminação não lítica foi demonstrada para vários picornavírus, durante os quais os vírus se apropriam de membranas intracelulares para facilitar sua liberação de células intactas, camufladas dentro de vesículas extracelulares1,2,3,4. Uma consequência dessa estratégia de transmissão é que, em vez da disseminação dispersiva de partículas virais únicas, os vírus são transmitidos em bloco dentro de pacotes membranosos5.

Modelos de organoides epiteliais são ferramentas interessantes para examinar respostas específicas de tecidos a insultos patogênicos6,7. Organoides esféricos 3D derivados de células-tronco adultas podem ser diferenciados para recapitular a diversidade de tipos de células presentes em tecidos nativos8. Os organoides normalmente crescem com suas superfícies apicais voltadas para os compartimentos luminais internos. Monocamadas polarizadas 2D ou organoides que foram cortados mecanicamente para permitir o acesso apical do Enterovírus A71 (EV-A71) foram usados ​​para modelar a infecção por EV-A71 do epitélio gastrointestinal9,10,11. Recentemente, métodos para inverter a topologia organoide foram desenvolvidos para apresentar a superfície apical do epitélio gastrointestinal para patógenos entéricos diretamente, preservando a integridade epitelial12,13. Neste artigo, esses organoides apicais são usados ​​para monitorar a infecção de células epiteliais por EV-A71 e subsequentes mecanismos de disseminação viral nesse tecido.

Estávamos interessados ​​em usar organoides epiteliais gastrointestinais apicais como um modelo de infecção por EV-A71 em que a integridade da barreira epitelial é mantida. Optamos por usar organoides derivados de tecido colônico (colonóides), devido à proximidade do cólon com a saída viral de um hospedeiro infectado, para entender melhor a transmissão do EV-A71. Colonóides derivados de tecido de cripta humana adulta foram cultivados em andaimes de membrana basal na presença de fatores-tronco, incluindo WNT e R-spondina, gerando esferóides de células-tronco com sua superfície basolateral voltada para fora e suas superfícies lumenais apicais voltadas para dentro. Cinco dias antes da infecção, os colonoides foram removidos do andaime da membrana basal e mantidos em cultura em suspensão na ausência de matriz para induzir a reversão da topologia do organoide, de modo que as superfícies apicais estivessem no exterior do organoide (apical-out)12. Ao mesmo tempo, foi aplicado meio para induzir a diferenciação celular. Nestes colonoides humanos apicais, monitoramos a organização do citoesqueleto de actina e do receptor EV-A71 SCARB2 (Fig. 1a). A superfície apical de colonoides bem diferenciados e polarizados contém microvilosidades de borda em escova, que são facilmente identificáveis ​​com coloração de actina F como uma camada espessa e rica em actina. SCARB2 é uma proteína de membrana lisossômica integral que circula para a superfície apical de monocamadas polarizadas14,15 e foi abundantemente expressa nesses colonoides apicais (Fig. 1a).